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BET体育365网址基因工程制药技术
浏览: 发布日期:2022-01-14

  BET体育365投注官网第章基因工程制药技术 第一页,共163页。 重组DNA技术是在分子水平对基因进行体外 操作,因而也称为分子克隆(molecular cloning)或 基因克隆。 所谓克隆(clone):是指通过无性繁殖过程所 产生的与亲代完全相同的子代群体。 第二页,共163页。 ? 分子克隆:是在体外对DNA分子按照既定的 目的和方案进行人工重组,将重组分子导 入到合适的受体细胞中,使其在细胞中扩 增和繁殖,以获得DNA分子大量复制,并使 受体细胞获得新得遗传特征的过程 ? 基因工程:利用分子克隆技术来操作目的基因 ,并改变生物的遗传性状的过程就称为基因工 程。 第三页,共163页。 第四页,共163页。 基因工程最基本的必备的材料: ? 工具酶 ? 载体 ? 目的基因 ? 原核或真核宿主细胞 第五页,共163页。 分子克隆的基本过程: 分:得到目的基因 切:将目的基因和载体用适当的限制性内切酶 切割 接:将目的基因和载体连接,形成重组子 转:将重组子转到适当的宿主细胞中 筛:筛选出含正确重组子的宿主细胞,扩增 第六页,共163页。 第一节 基因工程中常用工具酶 第七页,共163页。 工具酶分类 1. 使核酸降解的核酸酶类:核酸内切酶、核酸外 切酶 2. 催化核酸合成的酶类:DNA聚合酶,RNA聚 合酶,连接酶,逆转录酶 3. 核酸修饰酶类:甲基化酶,激酶,基团转移 酶, 磷酸酶等 第八页,共163页。 一、 限制性核酸内切酶 概念的提出及背景: 30年代初,微生物学家发现,微生物的噬菌体不 能交叉感染(“细菌免疫”)。 ? 限制现象(限制性内切酶) ? 修饰现象(甲基化酶) 1962年W. Arber提出;菌体中含有2种以上功能不 同的酶: ? 核酸内切酶(限制) ? DNA甲基化酶 (修饰) 第九页,共163页。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列,并以内切方式水解核酸 中磷酸二酯键的核酸内切酶。 第十页,共163页。 1.限制性核酸内切酶的分类: I型RE: 由三种不同的亚基组成。需Mg++,S-腺苷 甲硫氨酸(SAM),ATP为辅助因子;识别位 点复杂,特异性差。通常在识别位点的 400~7000bp范围内切割DNA。现已报道19种。 第十一页,共163页。 Ⅲ型RE;由两种亚基组成。需Mg++,ATP为 辅助因子;切割位点靠近识别序列但较难预测 。一般在25~27bp范围内切割。现已报道4种 。 I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基 化)两种功能并依赖于ATP,切割DNA链的位置 远离识别序列,因此I型和Ⅲ型酶在DNA重组 技术中都不常用。 第十二页,共163页。 Ⅱ型RE实际应用价值最大,这是因为: ①Ⅱ型酶只具有限制性活性,无甲基化修饰活性; ② 对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点,切割精 确; ③ 此类酶作用时只需Mg2+参与,无需ATP。 因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA 分子的常用工具酶,被誉为“分子生物学家的手术刀 ”。 第十三页,共163页。 2.限制性内切酶的命名 目前已广泛采用Smith和Nathams于1973 年提出的命名系统: ? 限制性内切酶第1个大写字母:来自细菌的属名 (genus), ? 第2、3个小写字母:来自种名(species), ? 第四个字母代表菌株(strain) 第十四页,共163页。 3.Ⅱ型限制性内切酶的作用特点: 被分子生物学家广泛研究应用,现已发现 有200多种识别序列的RE MW=60KD的单链多肽 最适pH:6~8 NaCl有抑制作用,Mg2+ 激活,巯基有保 护作用 热不稳定。 第十五页,共163页。 作用特点: 有严格的识别、切割的DNA序列,并以内切 的方式水解双链DNA中的磷酸二酯键。 识别序列一般为4~6个碱基对。 切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生 的DNA片段的长短 切割后产生平头或粘性末端。 只需Mg2+,不需ATP。 第十六页,共163页。 4. Ⅱ型酶切割dsDNA可产生两种不同的切口 1. 平头末端(blunt end) 即在识别序列的对称轴上 进行切割; 2. 粘性末端(cohesive end) 即在识别序列的两个 对称点切开DNA双链,产生末端带有单链尾巴的切口 。根据突出端不同分为:5’粘性末端和3’粘性末端。 第十七页,共163页。 Ⅱ型酶切割dsDNA产生的两种不同的切口 第十八页,共163页。 第十九页,共163页。 5. 三类特殊性质的Ⅱ型限制性内切酶: 同裂酶(isoschizomer):又称源同异工酶,即 识别位点相同,但切割位点可以相同,也可以 不同,例如Sam I(CCC↓GGG)和Xma I(C↓CCGGG) 第二十页,共163页。 同尾酶(isocaudarmer):不同来源的酶其识别和切 割序列有一定的相关性,作用后能产生相同的粘 性末端。 Sau3A I GATC CTAG BamH I GGATCC CCTAGG SauI GTCGAC CAGCTG Xho I CTCGAG GAGCTC 第二十一页,共163页。 可变酶:此种酶所识别DNA序列中的一个 或几个碱基是可变的,并且识别序列往 往超过6个碱基对,例如Bstp I识别序列 为:GGTNACC,其中N为一可变碱基。 第二十二页,共163页。 6. RE识别序列呈反向对称,分为四种类型 回文结构:(Palindrome) ↓ 如:EcoRI:5, —G AATTC—3, 3, —CTTAA G—5, ↑ 间断回文结构(interrupted Palindrome) ↓ 如:BgI:5,—GCCNNNN NGGC—3, 3,—CGGN NNNNCCG—5 ↑ 第二十三页,共163页。